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為什么擬南芥這么難養,需要專業人工氣候箱來養

日期:2018-08-06瀏覽:1364次

擬南芥
1.1播種和發芽
擬南芥可在非無菌條件下,生長在土壤或人工配制的各種培養基中。作為栽植的容器,可根據各自條件置于花盆或格狀分離的多穴塑料盤中。常用的混合物有泥炭蘚、營養土、蛭石和珍珠巖等,例如珍珠 巖∶蛭石∶泥炭蘚 =1∶1∶1的混合物,表土、堆肥或腐殖質土∶珍珠巖或蛭石 =1∶1,1∶2或 2∶1的混合物。如果用于營養研究則可以蛭石類惰性物質作培養介質,施以配有營養物質的水溶液。栽培擬南芥的介質均要求有良好的排水性,此一般混合砂子、蛭石等惰性介質,保持良好的排水,防止過濕引起真菌和昆蟲幼蟲滋生。播種前土壤混合物進行高壓滅菌處理 30min,以殺死可能存在于混合物中的任何害蟲。在把土壤混合物置于花盆或其他容器中后,將整個容器置于水或營養液中,靠毛細管作用浸濕介質,然后將處理洗凈來的種子,用尖頭燒融后的移液管小心移至土表,均勻播下。如果播種量較大,可用濃度為 0.1g/100mL瓊脂或砂子事先均勻混合后播種。種子發芽期間必須保持高濕度,故容器可用塑料膜復蓋,保持一周左右方可揭去。
將播有種子的容器移至低溫或相應低溫條件下,在 2~4℃下 放置 2~4d,從而于吸脹條件下破除種子休眠,這對新鮮收獲的擬南芥種子尤為必要。對大多數擬南芥品系來說其種子是中度休眠 的,收獲已久的這類生態型的擬南芥種子可免于低溫處理,而有些生態型甚至需長達7d的 低溫 處理。干種子的低溫處理往往是無效的。
低溫處理后,將盆移至溫室或生長室,在 22℃ 左右發芽,夜溫可比日溫低2℃,用 2000lx的熒光燈給予光照,光周期為18h光 /6h暗(也可24h光照
),在 5d左右可見擬南芥發芽。擬南芥發芽需光,故防止種子被土復蓋。
1.2生長發育條件的控制
擬南芥一般是冬性一年生植物,自然條件下種子在秋 天發芽,幼年期度 過冬天,花分生組織在春季分化,種子在夏季成熟脫落。大多數實驗室栽植的擬南芥品種在發芽后 4周開花,而在 4~6周后采集種子。不同擬南芥生態型其發育進程快慢、開花時間早晚、何時成熟等除了取決于遺傳性以外,也受外界環境條件的影響。
1.2.1光
光對擬南芥生長的影響涉及光強和光周期兩個方面。以光強度說,在生長室中一般zui適光的光強度為120~150μmol/(㎡ · s)(1μmol/(㎡· s)=5燭光 =0.217W/m 2 =53.8lx),這可通過熒光燈,配以白熾光來達到。在 夏天溫室中,60%蔭影有助于光強控制和溫度調節,高光強或直接太陽光照射對較老植株可以忍受,而年幼植株避免強光。
擬南芥在連續照光和 長日下開花加快,短日時開花被 阻遏或延遲,這表 明擬南芥開花需要長日照光周期,一般至少12h的光照。在冬季溫室中可補充早晚的光照,以滿足光周期需要,一般給以16h光照,8h暗期為宜。連續光照可促進生殖循環,略微提早開花,但使葉數減少及降低種生成,而較短日照有利于營養生長。
1.2.2溫度
溫室和生長室的溫度應予以控制,生長溫度 為25℃ 左右,稍低的溫度也是允許的。當水分供應充足時,植物甚至能在高達34℃ 時生長,但會減少受精。較老的植物能忍受高溫,但保持25℃對整個生長周期是有利的。當種子形成時,生長室溫度宜設 定在25℃,而溫室溫度宜在23℃,夜溫可比日溫低2~4℃為宜。
對于許多遲開花的擬南芥生態型來說,幼苗期要給以 4℃左 右處 理一 個時期(如幾周),以完成春化作用,從而在長日下促進開花。而對于常用的擬南芥生態型 Landsbergerecta和 Columbia則 不需作春化處理就能 開花。 必須注意這里的低溫春化處理是不同于播種時破除休眠的低溫處理,破除休眠的低溫處理又稱層積處理(stratification)。
1.2.3水分
在種子發芽后的頭幾周里,理想的供水是來自毛細管由下至上的滲水,只有當土壤呈現干旱時適時灌溉。過量供水會引起土表藻類和真菌的生長。在擬南芥頭兩片真葉開始伸展之前必須避免干旱,當真葉長出后,灌水頻率可相應減少,如每周一或兩次,而至長角果充實階段必須保證水分供應,以利于種子形成。澆水時待90%左右的穴盤或花盆完全干燥之后進行。
不僅土壤供水狀況影響到擬南芥的生長發育,而且濕度也會影響水分供給。雖然濕度的增加(如 50% ~60%)會大大減少土表干旱的影響以及發芽著的幼苗脫水危害,但一般說來擬南芥植株,包括幼苗都能忍受低濕度,處在蓮座狀階段的植株可在不同濕度下生長,當長角果進入成熟階段時,較低濕度(如 <50%)是有利的。
1.2.4營養
正常情況下只要配置合適的土壤混合物,就并非必須供給營養物質,但是貧瘠的營養狀況會降低植株高度,使它提早開花,并使種子著生減少。在生長發育的后期階段補充營養物質將會增 加種子著生,并產生較健壯的植 株。當植株呈現出輕微淡綠色時,表明營養供給不 足,則應立即施以營養物質,正常健壯的擬南芥植株是亮暗綠色的。
1.2.5防止雜交
擬南芥是自交授粉的,為了保持擬南芥品系的純化,必須防止溫室或生長室中各品系之間的雜交。為此可根 據各自實驗室條件進行設置。例如,保持生長環境的清潔,從而防止經昆蟲載體而導致的雜交機會。栽植時注意各品系種植之間的距離(如 20cm),從而防止來自不同品系的花互相接觸。在長成植株后,可采取適當措施,防止植株倒伏,以致互相接觸。
無菌培養

擬南芥之所以作為模式植物,其中一個原 在于可以在培養皿滅菌條件下進行突變體篩選。此外,在許多擬南芥研究方面也需要做無菌培養。無菌培養在擬南芥研究中的應用可歸納為以下幾方面:
(1)有利于突變體篩選 突變體篩選是遺傳和分子研究中十分重 要的手段,用無菌培養來篩選突變體有許多有利之處。首先,對大量擬南芥誘變處理的種子很容易進行生活力記錄。其次,生長在培養皿中的植物可在人工控制的條件下穩定生長,以致使實驗設計得以實現,這種突變體篩選方法十分類似于微生物突變體篩選的操作。例如對一些特殊化合物、除草劑、生長調節劑的敏感性可在同一野生型生長阻遏的背景下進行篩選,而如果在土壤條件下對這些化合物進行測試,則很難達到一致的生長 條件,會受到各種 素影響。再次,無菌培養下培養皿中的篩選還可在下一代同樣條件下重新測試和進行遺傳分析。
(2)在分子水平分析時,常需經基工程的方法 取得轉 基植物,而轉基植物獲得過程中,常采用抗生素篩選等手段,這就必須將 抗生素置于培養基中,在無菌條件下,使轉化有外源基的個體存活,而淘汰未轉化的組織。
(3)一些實驗操作過程中,為達到某種目的,必須進行無菌培養,例如在用無菌或無真菌的組織進行組織培養,種子發芽測試等。
(4)一些突變體由于缺少了或降低了對生長調節劑的敏感性,或 者缺少了特殊代謝途徑中的某個基,而 生長十分弱時,必須在特殊培養基上發 芽和生長,然后才轉入土壤中繼續生長。
2.1無菌培養的培養基組成
普遍的培養基是1倍或0.5倍濃度MS培養基,其中加入瓊脂達 0.6% ~0.8%的濃度,可另加蔗糖至 0% ~3%。也有實驗采用 GamborgB5培養基。以下列出一種培養基配方:
培養基組成濃度
MS基本培養基鹽類
4.4mg/mL
蔗糖 10mg/mL
肌醇 100μg/mL
硫胺素 1.0μg/mL
吡哆醇0.5μg/mL
煙酸 0.5μg/mL
MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸] 0.5mg/mL
在上述配制溶液中,加入 1mol/LKOH調 pH至 5.7,在加入適量瓊脂或蔗糖后,滅菌,貯存。當需鋪平板時,將貯藏培養基置于微波爐中熔化,即可將其倒至培養皿中。0.8%瓊脂濃度有利于在不傷根的情況下取出培養的小植株,并移植至土壤。蔗糖用作碳源,有利幼苗茁壯生長,但對只需短時間發芽生長的處理可免去蔗糖成分。
2.2種子滅菌和播種
種子表面滅菌可采用漂白劑、乙醇等,另可附加 SDS,TritonX-100等。例如,將擬南芥種子用含 0.001% ~0.2% SDS的 50%漂白劑處理 10min,或 者將種子在 50%乙醇中浸潤1min再用漂白粉處理。其中SDS也可用 0.1% TritonX-100代替,用無菌水淋洗晾干。如果滅菌過程不采用漂白粉,可將種子在50%乙醇和 0.5% Triton中放置 3min,再用 95%乙醇淋洗,并令其快速風干。
病蟲害及其防治

作為模式植物栽培時,為了使植株正常生長,培養出有代表性的群體以及潛在的新突變體在早期篩選過程中不致病蟲害侵襲而使 表型丟失,所以必須注意病蟲害防治。只要采取適當的措施,溫室或生長室的病蟲害是可以預防的。病蟲害可能來自土壤,種子或操作人員本身。防治的原則應以防為主,殺滅為輔。積極的措施是保持培養環境的清潔。
常見擬南芥病蟲害及一般癥狀
1.蟲害
1.1蚜蟲(aphid)
蚜蟲聚集在葉和花 莖上,在莖、葉上分泌密 露,咬食幼小組織致使葉扭曲,嚴重時可引起萎蔫甚至死亡。
1.2薊馬(thrip)
葉上呈現銀色或白色斑點,此薊馬科害蟲在花序上積聚,并使受精受阻。
1.3蘑菇蠅(mushroom fly)
在地上部未有明顯傷害情況下植株長勢弱,葉變黃,在根組織上可見到灰白的蛆,蛆在根上覓食。成年蠅聚集在植株周圍,有時以蠅斑呈現。
1.4紅蜘蛛(redspidermite)
在干、熱條件下易侵染,葉被造成銀色斑點,嚴重時植株變黃,萎蔫。葉下表面被細白絲線懸浮的白粉蒙蓋。
1.5白蠅(whitefly)
在葉下表面呈現,成 蟲是 小白蠅。若 蟲為淺綠色。它通過吸食汁液侵害植物,侵染導致植株長勢減弱,萎蔫,死亡。
2.病害
2.1白粉病(powderymildew)
在葉花莖、長角果上呈現白粉斑,嚴重時會造成植株萎蔫,死亡。
2.2灰霉病(botrytis)
灰色毛狀霉菌呈現在植株表面,葉隨之腐爛,有時可能伴隨物質的降解。

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